冷凍切片

一、 恒溫冷凍切片

將組織在恒溫冷凍切片機里切片。冷凍腔內的溫度一般設置為-18至-25℃，根據不同組織調節不同

的腔溫，平時應將冷凍頭放置于冷凍臺上。冷凍切片機應長期處于恒溫冷凍狀態。

(1)、 當冰凍組織取好后，有速凍開關的機器可先將開關打開，再在冷凍頭上放少量的OCT或羧甲基

纖維素(可用普通膠水代替)，放上組織，速凍。

(2)、 待組織凍結后，將冷凍頭裝到冷凍切片機上

(3)、 粗切，修出切面細切幾張，用毛筆刷去刀上組織片

(4)、 放下抗卷板，開始切片，切片厚度一般為5～6微米，切出的片子用載玻片貼附后立即放入甲醇

冰醋酸液（97ml甲醇+3ml冰醋酸）中固定，固定時間為10～20秒

(5)、 水洗

(6)、 蘇木素1分鐘

(7)、 水洗

(8)、 鹽酸酒精分化1秒鐘

(9)、 水洗

(10)、溫水藍化

(11)、伊紅2～5秒鐘

(12)、梯度酒精快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

冰凍切片的注意事項:

(1) 速凍：是冰凍切片的關鍵，因為只有速凍才能減少組織內的冰晶，最好的辦法是將速凍頭迅速壓

在組織上，凍好后就可切片。特別適用于較脆的組織。而含有脂肪較多的組織，最好放在液氮里處

理。在液氮里冷凍要注意不要凍過頭，2～3秒鐘就要拿出來看一下，只要有4/5的組織已經凍住就可

以了，待冷凍頭拿出后剛好全部凍住，否則就會引起組織發脆，或冷凍頭與組織分離。

(2)固定：切片后應立即放入甲醇冰醋酸中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成細胞退變。

固定液有很多種，根據我們的實踐，認為甲醇作用快，收縮小，染色較清晰，是冰凍切片最理想的固

定液， 而每97ml加入冰醋酸3ml，會減少某些膠質、鈣質較多的組織不容易掉片。

(3)包埋劑：可用普通膠水代替，但要加入適量的水（膠水與水的比例大約在2：1左右）。太稀了，

容易損傷切片刀；太稠了，粘在切片上不容易洗掉,影響切片的質量。

(4)冰凍用切片刀不僅要磨的快，而且要磨的直，否則切出的片子就不會平整,不能進入抗卷板。最好

能使用一次性刀片。

(5)如組織發脆，可等幾分鐘后再切，也可用手在組織上稍稍加溫；如果用手去摸組織塊，最好戴手

套，或用玻片間的紙夾在手與組織之間，以防感染。

(6)冷凍室的溫度冬天一般設在-19℃左右，夏天設在-22℃左右。不同的組織,有不同的溫度要求:肝

臟、甲狀腺組織溫度控制在-15℃左右，脂肪組織一般在-35℃以下。

(7) 冷凍切片機應長期處于恒溫冷凍狀態，經常的開關機器電源容易造成壓縮機損傷。

二、半導體制冷切片

(1) 組織放置在半導體制冷臺上，加少量水，調好切片的厚度

(2) 接通循環流水后，再接通電源，在使用的全過程中不能中斷流水，等電源關上后才能停水。并且

正負極不能接反，用整流電源控制溫度。冷凍組織周圍的水不能過多

(3) 待組織發硬到可切成厚薄一致的切片時，即可切片。切片厚度5～6微米，切片用毛筆展平后，立

即放入甲醇冰醋酸液中固定，固定時間為1分鐘

(4) 蘇木素1分鐘

(5) 水洗

(6) 鹽酸酒精分化1秒鐘

(7) 水洗

(8) 溫水藍化

(9) 伊紅2～5秒鐘

(10) 梯度酒精快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

三、二氧化碳冷凍切片

a) 先將組織放入加熱的20%甲醛溶液中固定1～2分鐘，水洗(也可將組織不經固定直接放在切片機的

冷凍臺上)

b) 放在切片機的冷凍臺上，加少量水，打開二氧化碳開關，此時有二氧化碳氣體噴出，待組織出現

冷霜后，關閉二氧化碳

c) 切片，切片厚度6～8微米，將切出的片子放于水中舒展，用鑷子將組織平鋪于載玻片上(如未固定

組織的切片直接用載玻片粘貼，立即放入甲醇中固定2秒，然后進行染色，)

d) 加熱烤片，烤片溫度不宜超過60℃，更不能將組織烤焦。

e) 染色時將蘇木素滴加在載玻片上，加熱1分鐘(60℃左右，不能將蘇木素燒開，以防切片脫落)

f) 水洗

g) 鹽酸酒精分化1秒鐘

h) 水洗，溫水藍化

i) 伊紅2～5秒鐘

j) 梯度酒精快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

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